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本制品是基于荧光染料检测的即用型PCR试剂盒，可以对靶片段进行实时定量PCR分析。产品含有经过优化的缓冲液组分、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂及SYBR Green I等所有实时定量PCR所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行实时定量PCR反应，具有广泛的用途。

• 方便，用户只需准备模板和引物即可以进行实时定量PCR实验。
  
• 产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
  
• 扩增效率和灵敏度更高。
  
• 可以扩增30～48kb DNA。
  
• 快捷，即用型的预配液使加样操作步骤简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
  
• 各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
  
• 本规格有1mL，足够100次20μL体系的染料法荧光定量PCR。

• 如果有N个样品（最好含一个样本制备阳性对照和一个样本制备阴性对照）并且做定量分析，最好设置N+7个反应，多出的7个中，6个用于6点标准曲线，一个是扩增阴性对照（NC）。在N+7个PCR管中，加入下列成分。如果是做定性分析，则6个做标准曲线的样品缩减成一个扩增阳性对照（PC），用户自己需要根据下表进行适当修改（把6个标曲反应改成1个阳性对照反应）。
  

  成分	N个样品管	6个标准曲线管	NC管
  2×染料法实时长链PCR预混液	各10μL	各10μL	10μL
  自备引物1（10μM）	各1μL	各1μL	1μL
  自备引物2（10μM）	各1μL	各1μL	1μL
  基因组DNA	10～100ng	-	-
  或cDNA	1～10ng	-	-
  自备阳性对照模板（6各梯度）	-	各1μL	-
  阴性对照模板(一般用水)	-	-	1μL
  自备50×ROX	各0.4μL/-	各0.4μL/-	0.4μL/-
  超纯水	至20μL	至20μL	至20μL

  • 不需要ROX的机型：Agilent MX3000和MX4000、iCycler IQ、LightCycler480、Smart Cycler System、Thermal Cycler Dice Real Time System等型号的荧光PCR仪器不需要加ROX染料，但加入的话也不会影响整个PCR分析。
    
  • 需要使用ROX I的机型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step One、Step One Plus。
    
  • 需要使用ROX II的机型：ABI Prism7500、7500 Fast、MJ Opticon、MJChromo4、Corbett RotorGene 3000。
• 放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考。
  

  步骤	反应参数	备注
  预变性	94℃ 1分钟	变性条件根据使用的PCR仪型号和反应管种类进行设定94℃时设定为20～30秒、98℃时设定为5～10秒。
  PCR反应 （35～45次循环）	98℃ 10秒
  	68℃ 15秒
  终延伸	72℃ 10分钟
  溶解曲线分析	按qPCR仪器手册执行

• 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟扩增阳性对照Tm不一样的样品（包括对照和待测样品），归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟扩增阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
  
• 如果两种阴性对照（样本制备阴性对照和扩增阴性对照）的溶解曲线所得Tm值跟扩增阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
  
• 如果两种阴性对照（样品制备阴性对照和PCR阴性对照）是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
  
• 对定量检测，以6个标准曲线样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
  
• 对定性检测，则得到有效Ct值的样本为阳性，无有效Ct值的为阴性。